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骨缺損修復--細胞移植及其載體選擇

發布時間:2003-10-14作者:來源:瀏覽次數:2673

  大塊骨缺失和萎縮性骨不連的治療常十分困難。理想的治療方法不但要恢復骨的完整性和連續性,而且還要盡可能縮短這種恢復所需要的時間,使骨骼盡早獲得正常力學性能,避免因不負重或制動時間過長而引起的廢用性肢體功能喪失。
目前常用的治療方法包括自體或異體骨移植(松質骨或皮質骨)、人工骨(羥基磷灰石或生物陶瓷等)移植以及各種骨誘導劑(轉移生長因子TGF-β或骨形態生成蛋白BMP)與人工骨的結合應用。
從骨形成的生物學特性來看,理想的骨移植物應包括三種要素:骨生成性、骨傳導性和骨誘導性[1]。因此,除新鮮自體骨外,目前還沒有一種理想的骨移植復合物同時具有上述三種要素,而達到新鮮自體骨移植的效果。

l 骨生成性(osteogenesis)
       骨生成性指的是骨移植物的骨形成能力,也就是移植物本身是否帶有能形成骨組織的細胞[1]。目前常用的骨移植物中,只有新鮮的自體骨具有這種骨生成性。為了彌補其他移植物骨生成性的缺乏,通常采取髓腔再通、骨膜保留和局部的富血供化等措施,希望髓腔或骨膜部位的骨生成細胞能進入到骨缺損處。但其效果并不令人滿意。這主要有兩種原因(不考慮異體骨的免疫性):1. 這幾種移植物的成骨修復過程一般要經過以下幾個步驟:有成骨潛能的細胞的遷移、增殖、分化、成骨以及新骨的整合和塑型。在這個過程中,細胞的遷移非常緩慢,從而使得骨形成過程相當漫長。2. 骨形成過程的起始與成骨細胞數量、密度有關,只有當成骨細胞密度達到一定程度(5′105/36mm3)時,才開始有骨形成[2]。但是,骨髓中的成骨潛能細胞數量非常有限,僅為成纖維細胞的萬分之一[3],而且隨著年齡的增長逐步減少[4]。由于這兩種原因,在漫長的骨形成完成之前,移植物有可能已經或正在被吸收,失去了為新骨提供支架的作用。
        因此,盡量縮短細胞的遷移時間和提高細胞的初始密度,有利于增強骨生成性、加快骨形成。
m 自體骨髓的成骨特性
       1982年,Takagi用小鼠的自體骨髓移植,來修補其股骨的節段性缺損,獲得成功。實驗中他發現如果封閉髓腔殘端,則沒有新骨形成。如果髓腔封閉后再植入自體骨髓,則可見明顯的骨形成。Nade將自體骨髓結合生物陶瓷進行異位移植,也見到了骨組織的形成。
       在此基礎上,有人進行了一組對照研究,自體骨髓加多孔陶瓷組植入小鼠股骨節段性缺損部,有非常明顯的骨形成,并與殘端有良好的整合,而單純的陶瓷組的骨形成卻要少得多。由此可見,把具有成骨潛能的細胞直接植入缺損部位,在特定時間段內可見明顯的骨形成,也就是說,這種植入加快了成骨速度,這主要是因為省去了緩慢的細胞爬行時間。
不過由于骨髓中的成骨潛能細胞的數量較少,這種簡單的移植后還需要有一段細胞增殖時間(新鮮自體骨移植也有同樣的問題),達到一定細胞密度后,才開始骨形成。
m 骨髓間充質干細胞
       一般認為骨髓含有兩類組織成份:造血干細胞和其分化的子代細胞,以及稱為基質的結締組織。在基質中又存在著無成骨性的脂質細胞、網狀細胞、內皮細胞和成纖維細胞。但骨髓基質中還存在一種能對BMP起反應的細胞。如果進行骨髓培養,在培養的細胞中會有一種堿性磷酸酶(AKP)陽性細胞,其AKP活性能被甲狀旁腺素抑制、VitD3促進,而且在VitD3存在的情況下,其骨鈣素合成增加。進行骨髓異位培養可有膠原性基質形成 ,為Ⅰ型和Ⅱ型膠原[21]。在鼠體異位培養中,骨髓細胞有骨、軟骨組織形成?;谝陨蠋c,W?odarski認為這些細胞可能來源于間充質細胞,因為骨、軟骨、肌腱等本來就發生于胚胎的中胚層,在特定的條件下,間充質細胞能發育成前成骨細胞和前成軟骨細胞[2]。隨后的實驗進一步發現骨髓細胞在血供豐富的部位形成骨,缺乏血液的地方則形成軟骨,這與胚胎骨、軟骨的發生非常相似,而且這些部位的細胞形態與成骨和成軟骨細胞非常接近。Caplan把這一類細胞稱之為間充質干細胞(mesenchymal stem cells)[5]。它與造血干細胞一樣是具有多分化潛能的增殖型細胞,在特定的條件下,分化后能夠形成骨[3,6,7,8,9]、軟骨[10,11,12]、肌腱[13]、脂質細胞[14]和支持造血干細胞分化的結締組織細胞[15]。
          近來的研究證實這類細胞的確是一種獨立的細胞系,而不是由其他細胞分化而來的。其表面受體存在特異性[16](如CD44[17]),不具有造血系細胞獨有的CD14、CD34和CD45等表面抗原[18]。
       Goshima首先對間充質干細胞進行了分離培養。他發現骨髓細胞培養一段時間后,出現一種成纖維細胞樣的梭型貼壁細胞,具有成骨和成軟骨活性,他認為這種細胞就是間充質干細胞[6]。Haynesworth證實這種細胞移植后的局部成骨反應的確來源于該種細胞,而非宿主細胞[19]。隨后的報道進一步表明不論鼠、兔、狗和人,通過這種方法培養增殖的細胞都具有成骨和成軟骨特性,而且這種特性不因供體的年齡而改變[7,8,9,11,12]。另外,這種細胞形成的骨組織中可出現骨髓樣組織[7]。1998年Bruder利用培養的間充質干細胞結合多孔生物陶瓷移植,成功地修復了狗股骨節段性缺損[20]。
       這種細胞在骨髓中數量很少,在狗大約占骨髓有核細胞的1/25000[12],而人約為狗的1/4[3]。但他們的增殖速度很快,Bruder研 究表明,人的間充質干細胞在原代培養的初始約為500個/培養皿,到原代培養末期能擴增到6.1′105,傳代后以每兩天倍增一次的速度擴增,這種幾何級數的擴增能持續10代左右[8]。而且隨著細胞的增殖,其細胞性狀和分化潛能并不會改變和喪失[3,6,8,9]。一般認為人的骨髓每毫升有200個左右的間充質干細胞,在體外可以倍增30次,那么,細胞總數將達到最初的十億(230)倍,這相當于數千升的骨髓。因此,這種易擴增性使得我們只要進行很短時間的培養擴增,就能產生足夠數量的細胞來填充骨缺損部位。
        骨髓間充質干細胞具有良好的骨生成性,其可分離、易培養擴增特性不但很好地解決了骨髓中成骨潛能細胞數量不足或局部缺乏(萎縮性骨不連)的問題,也解決了骨生成性方面的兩個難題(遷移速度和初始密度),大幅度縮短骨缺損修復時間。

l 載體的選擇
       當選擇間充質干細胞作為骨形成來源時,也應選擇一種合適的細胞載體,并為細胞提供適宜的局部環境和成骨支架。Goshima曾把細胞直接注入動物體內,結果發現沒有骨形成[6]。臨床上也有類似現象,一個較大的新鮮骨缺損的自行修復通常是不完整的,并不能把整個缺損空間填滿。
        理想的載體應該具有良好的生物相容性、骨傳導性、一定的骨誘導性、可生物降解、有利于細胞貼附和血管長入,以及一定的抗負荷能力[1,15]。目前可供選擇的載體可分為兩大類:同種異體骨和人工合成骨,每一類又可細分成數種。不過最常用的只有兩種,凍干異體松質骨和多孔生物陶瓷。
        植入物應當盡可能少地引起宿主排斥和異物反應。炎癥不但阻礙骨形成,而且還會引起細胞死亡。常用的人工合成骨具有良好的生物相容性,尚未見其引起明顯炎癥反應的報道。異體骨會引起一定的免疫排斥反應。目前認為其免疫原性來自于骨組織中的細胞,而非骨基質成份。當異體骨經過凍干處理后,其抗原性能被降到最低[1]。最近已有研究發現,通過免疫誘導耐受,能消除或減低宿主對新鮮異體或異種骨的免疫排斥。
       所謂骨傳導性是指載體為新骨形成提供支架的特性。沒有這種支架,新骨很難形成,即使能夠形成,也將是雜亂無章毫無用處的骨組織。骨傳導性取決于植入物內在的構造。首先必須具有一定的孔隙率,提供足夠的面積供細胞附著,便于血管長入和以后的降解。皮質骨移植常不能獲得滿意的骨形成,并遺留下死骨,正是因為其缺乏應有的孔隙率[1]。骨組織只能在那些能保護成骨細胞免受其他組織侵襲(encroachment)的孔隙中形成[21]。另外,孔的大小也會影響成骨活動,過小的孔徑沒有足夠的空間供細胞生長和營養血管的長入,影響細胞分泌基質和營養物質的滲入。Nade認為孔徑應大于100mm,最好在200-400mm之間[21],過大的孔徑則會影響載體的力學性能。目前的多孔生物陶瓷已能完全滿足這兩個條件,并可觀察到血管長入和新骨形成[6],但是它不能滿足骨傳導性另外一個條件--孔隙的連通性??紫恫幌嗤ㄊ沟眯鹿侵g不能相互連接,而缺乏連續性和整合性     (incorporation),血管常不能進入到這些孔的盲端,因而在這個部位只能形成軟骨樣組織[6,19,22]??傊?,載體只有具備了類似松質骨樣的結構,才能獲得最佳骨傳導性[23]。另外,人工骨只是一種無機材料,缺乏細胞附著所需的整合素和附著性受體等有機物質[21],細胞吸附能力可能要小于天然骨。
        單純的人工骨沒有骨誘導性。當其攜帶間充質干細胞植入骨缺損部位時,細胞的分化將依賴于缺損部的局部環境。問題是骨缺損部位常常不能提供適宜的骨誘導環境。有人試著把細胞誘導因子結合到人工骨上[21],增加其骨誘導性,但是結合的量非常有限。細胞分化需要許多因子共同參與,單純的一種誘導成份作用有限。目前已知的存在于骨基質中的骨誘導物質除了TGF-b、BMP、PDGF(血小板衍生生長因子)、IGF(胰島素樣生長因子)、bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)外,骨基質的其他成份也有骨誘導作用[24,25],例如,整合素和附著性受體[21]、Ⅰ型膠原[7]等。目前已知冷凍的骨組織仍保留有這些誘導成份,冷凍干燥處理后的情況則有待于證實。
        從上面討論的載體要求來看,最符合要求的首推自體松質骨。當自體骨來源受限時,凍干異體松質骨可能要優于多孔生物陶瓷。目前還沒有見到異體骨做載體的報道,這可能是由于凍干處理不能去掉異體骨可能攜帶的傳染性病毒[26]或供體骨本身的病變[27]。不過只要嚴格選擇供體,可將這種可能性降到最低程度。

l 總結
         理想的骨移植物應當具備骨生成性、骨傳導性和骨誘導性。當新鮮自體松質骨不能滿足臨床需要時,間充質干細胞結合凍干異體骨移植有可能獲得接近于新鮮自體松質骨的效果,不僅可以治療骨缺損、骨不連,而且還能加快因成骨細胞不足而愈合緩慢的老年性骨折。但這個推測尚需證實。目前在這一方面還有一系列的問題沒有闡明。例如:
人體細胞特別是這種多潛能增殖型細胞的體外培養是否會改變這些細胞的正常生物學性狀,而使細胞獲得惡性特征?現有的資料都沒能回答這個關鍵問題。
        另外,間充質干細胞目前已經能在體外被誘導為成骨細胞。從加快骨形成的要求來看,這種體外誘導的成骨細胞似乎最理想。不過成骨細胞屬于功能型終末細胞,增殖能力和壽命有限[17],當其凋亡后,局部又會再次出現骨生成性的缺乏。而且這種分化細胞在傳代培養后常常失去其固有的表型屬性(phynotype property)[14]。因此,從兼顧兩者考慮, 部分誘導應該是最佳選擇,而且,已分化的細胞能夠分泌細胞因子,反過來促進間充質干細胞的增殖和分化[26],從而進入一個良性循環。當然最佳誘導比例也有待于進一步的研究。
        為了最大限度提高局部細胞密度,就要盡可能多的將細胞轉移到載體上。這過程中的條件控制同樣有待摸索。
最后,間充質干細胞結合異體骨移植優于間充質干細胞結合多孔陶瓷移植只是一種理論上的推測,其實際效果也需要驗證。

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